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Northern blot中用紫外交联仪将RNA与膜交联

发布时间:2024-06-26 21:00:09 人气:175 来源:析浦(上海)科学仪器

RNA的膜转移和交联

组织或细胞培养物中mRNA表达的分析通常通过Northern blot或核糖核酸酶保护测定(ribonuclease protection assay, RPA)进行。Northern测定需要先将总RNA在变性琼脂糖凝胶上分离,然后转移到膜上并固定以进行后续杂交。非同位素RPA利用用修饰核苷酸标记的探针(例如生物素、地高辛、荧光素或合适的半抗原),从变性聚丙烯酰胺凝胶转移到膜上,通过二次检测方案(例如链霉亲和素/亲和素结合物或抗地高辛和抗荧光素抗体)进行检测。

由于这些技术使用不同类型的凝胶,因此每种情况下的转移方式都不同。琼脂糖凝胶用于Northern blot,因为它们具有广泛的分辨能力和较大的负载能力。它们的多孔性允许核酸有效地被动转移到膜上。聚丙烯酰胺凝胶的特点是分辨率更高,但负载能力较低。聚丙烯酰胺凝胶基质的性质不允许通过被动扩散进行有效转移,因此改用电印迹法。

市面上有多种膜适合用于RNA分析,它们由不同的材料组成,并带有不同的电荷。常见的膜由尼龙和硝化纤维素制成,可能为中性、带负电或带正电。尼龙(聚酰胺)膜由最耐用的材料制成,但暴露于有机溶剂中时会收缩或弯曲。硝化纤维素在洗涤步骤中容易撕裂,如果烘烤则变得非常脆弱易碎。它也与二次检测步骤不相容,因为蛋白质容易吸附到表面,并且不会特异性地结合探针上的半抗原。中性膜的表面实际上包含等量的带正电和带负电的分子。总净电荷为零,但由于正电荷密度较高的区域,可能会产生斑点状背景。带负电的膜提供最干净的背景,但会导致较差的特定信号。带正电的膜提供更好的信号,但它们也会导致更高的背景。尽管带正电的膜的信噪比低于其他类型的膜,但它们允许的较低水平检测限弥补了这一缺点。

紫外交联仪进行RNA与膜交联

有两种方法可将RNA固定在膜上。一种是传统的方法,将膜放在80°C的烤箱中烘烤,另一种更常用更高效的方式是,使用紫外交联仪XEPU-1208

使用紫外交联仪进行RNA膜交联的原理是,短波紫外线使RNA中的含氮碱基(主要是尿嘧啶)变得高度活跃,并与膜表面的胺基形成共价键。潮湿的膜需要大约120mJ/cm2的紫外剂量。上海析浦紫外交联仪出厂预设了120mJ/cm2的紫外照射剂量,一键即可快速照射。须注意,不要让RNA暴露在紫外线下不足或过度,这两种情况都会降低杂交信号。通常用254nm短波紫外线照射一分钟,或用302nm中波紫外线照射三分钟就足够了。

紫外交联仪XEPU-1208,配有6根254nm紫外灯管,提供稳定、高强度、大面积的紫外辐照。辐照室内面积32x16cm,可容纳多组96孔板同时照射。如果您有关于northern blot中使用紫外交联仪进行膜交联的任何问题,欢迎联系上海析浦的工程师获取技术支持。

下图:紫外交联仪XEPU-1208,专为膜交联设计

northern blot中用于rna膜交联的紫外交联仪XEPU-1208

UV Crosslinker XEPU-1208 used for crosslinking RNA and membrane


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