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紫外灯用于Flex-T™单体和紫外线诱导的肽交换

发布时间:2024-03-17 16:26:09 人气:223 来源:析浦(上海)科学仪器

Flex-T™(Flexible-Tetramers)是BioLegend可溶性MHC产品线的品牌名称。它涵盖单体、紫外线 (UV) 肽交换技术以及所有相关产品和应用。Flex-T™ MHC单体装载有可通过使用紫外线光源降解的肽。当感兴趣的肽(对紫外线不稳定)存在时,进行紫外线照射,进行肽交换。这种灵活性允许筛选几乎任何对其所加载的MHC等位基因具有足够亲和力的感兴趣肽。

Flex-T™ HLA-A*02:03 Monomer UVX提供了在组装四聚体进行流式细胞术分析之前将预加载的紫外线敏感肽交换为其他感兴趣的抗原肽的灵活性,还可用于筛选能够与 HLA-A*02:03 等位基因形成稳定复合物的肽表位。

使用紫外线诱导的肽交换,可以使用Flex-T™单体生成MHC/肽单体,这些单体在其结合槽中含有感兴趣的肽。这些新的MHC单体随后使用链霉亲和素-荧光团缀合物进行多聚化。由此产生的Flex-T™试剂可用于抗原特异性T细胞染色和流式细胞术分析。在人体中,MHC 分子称为HLA(人类白细胞抗原)。

下图:Flex-T单体和紫外线诱导肽交换的示意过程

Flex-T单体和紫外线诱导肽交换

CD8+T细胞是免疫系统的重要组成部分。它们通过TCR识别由I类MHC(人类 HLA)分子呈递的抗原(肽表位)发挥作用。因此,同源MHC/肽复合物的TCR识别可用于检测抗原特异性CD8+T细胞。由于MHC/TCR相互作用固有的低亲和力,抗原特异性T细胞的检测需要通过MHC/肽单体的多聚化来增强结合亲和力,确保多个MHC/TCR同时相互作用。这可以通过使用链霉亲和素使生物素化的 MHC I 类复合物四聚化来实现。

如果没有适当的肽结合,HLA I 类复合物将迅速解离。Flex-T™ UVX(紫外线交换)单体被设计为生物素化的α链,与β2微球蛋白链相关,并通过紫外线不稳定的肽进行稳定。α链的C末端被BirA酶进行位点特异性生物素化。当复合物(单体)在具有适当亲和力的新肽存在的情况下用紫外线照射时,将导致净肽交换。新肽取代了预加载的紫外线不稳定肽,并形成新的MHC单体。 然后可以将新单体四聚化并用于标记抗原特异性T细胞或其他研究。

紫外线肽交换所需材料

  1. 磷酸盐缓冲盐水pH 7.4,10X浓缩液(PBS,BioLegend Cat# 926201)

  2. Flex-T™单体

  3. DMSO中选择的10 mM肽溶液

  4. DMSO(例如 Sigma-Aldrich Cat#D5879)

  5. 50 mM D-生物素(例如 Thermo Fisher,Cat#B20656)

  6. 10% (w/v) NaN3(例如 Sigma,Cat#S2002)

  7. 荧光团缀合的链霉亲和素(BioLegend Cat# 405203、Cat# 405207、Cat#405225 或同等产品)

  8. 细胞染色缓冲液(BioLegend Cat#420201 或同等产品)

  9. 96 孔聚苯乙烯微孔板,U 形(例如 Falcon Cat#353077)或 5mL、12 x 75mm 管(例如 Falcon Cat# 352008)

  10. 板封口机(BioLegend Cat# 423601)

  11. 1.5 mL 管(例如 Eppendorf Cat# 022364111)

紫外线肽交换所需设备

  1. 紫外线灯,长波紫外线,366 nm,8瓦(推荐长波紫外灯XEPU-1328L紫外交联仪XEPU-1208L

  2. 培养箱(37°C)

  3. 能够容纳微量滴定板和管的离心机

  4. 能够准确输送可变体积的单通道和多通道移液器以及移液器吸头

下图:长波紫外灯XEPU-1328L搭配支架使用,可用于紫外线诱导的肽交换实验

长波紫外灯XEPU-1328L用于紫外线肽交换

紫外线肽交换的步骤

  1. 将所有试剂放在冰上,使其温度达到0°C。

  2. 通过将5μl肽储备溶液与120μl PBS混合,将所选肽的10mM储备溶液稀释至400μM,并保持在冰上。

  3. 将20μl稀释肽(400μM)和20μl条件Flex-T™单体(200μg/mL)加入96孔板中。通过上下移液混合。

  4. 封板,在4°C下以3300xg离心2分钟以收集液体。

  5. 拆除密封件,将板放在冰上,用长波紫外灯XEPU-1328L照射30分钟(照射距离应为2-5厘米);或放入紫外交联仪XEPU-1208L中,在键盘上输入照射时间为30分钟。

  6. 封板,在37°C的黑暗中孵育30分钟。

  7. 为了评估肽交换的效率,遵循HLA I类ELISA方案来评估肽交换。

下图:用于紫外线肽交换的紫外交联仪XEPU-1208L,可通过键盘直接设定照射时间,进行快速便捷的紫外线肽交换

用于紫外线肽交换的紫外交联仪XEPU-1208L

紫外线肽交换的注意事项

  1. DMSO可用于溶解肽。但是,交换反应中的最终浓度不要超过 10% (v/v)。

  2. 避免反复冻融。

  3. Flex-T™/肽溶液需要尽可能在黑暗中保存在冰上。不要在窗前工作。

  4. 使用短波长 (254 nm) 或宽带紫外线灯对MHC复合物有害。

  5. 使用前将所有小瓶离心(4°C 下 3000xg 1 分钟)。

标签:紫外灯, 紫外交联仪,
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