PCR技术的基本原理

什么是PCR?

聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction，PCR) 是一种广泛用于快速制备数百万至数十亿份特定DNA样本的方法，使科学家能够充分放大非常小的DNA样本（或其一部分），以便进行详细研究。PCR 是基因检测和研究中使用的许多程序的基础，包括古代DNA样本的分析和传染源的鉴定。使用PCR，极少量DNA序列的副本在一系列温度变化循环中呈指数扩增。PCR是医学实验室研究中不可或缺的技术，其应用范围广泛，包括生物医学研究和刑事取证。

PCR是1983年由美国生物化学家Kary Mullis在Cetus公司发明的，Mullis和生物化学家Michael Smith于1993年共同荣获诺贝尔化学奖。

PCR原理

大多数PCR方法依赖于热循环。热循环使反应物经历重复的加热和冷却循环，以允许不同的温度依赖性反应，特别是 DNA熔化和酶驱动的DNA复制。PCR使用两种主要试剂：

1）引物primers：短的单链DNA片段，称为寡核苷酸 (oligonucleotides)，是与目标DNA区域互补的序列

2）DNA聚合酶 (DNA polymerase)

通常，PCR由一系列20-40次重复的温度变化组成，称为热循环，每个循环通常由两个或三个离散的温度步骤组成（见下图）。在每个循环中使用温度和时间长度取决于各种参数，包括用于DNA合成的酶、反应中二价离子和dNTP的浓度以及引物的熔化温度。

PCR实验中，首先DNA双螺旋的两条链在高温下物理分离，这一过程称为核酸变性 (nucleic acid denaturation)。

PCR第二步，降低温度，引物与DNA的互补序列结合。 然后，两条DNA链成为DNA聚合酶的模板，以酶促方式从游离核苷酸（DNA的组成部分）组装出新的DNA链。 随着PCR的进行，产生的DNA本身被用作复制模板，引发连锁反应，原始DNA模板呈指数扩增。

下图：PCR中反复的加热和冷却循环

PCR污染

PCR是一种极其敏感的技术，研究人员可以从几个初始拷贝中产生数百万份特定DNA序列。虽然这种灵敏度非常有用，但它也有缺点。如果来自实验室环境的DNA片段，例如在以前的PCR实验中扩增的DNA模板，进入PCR反应或试剂，即使数量很小，也可以在反应过程中扩增。这种污染和非特异性扩增可能导致误导性结果，如假阳性。如果你是PCR实验的新手，那么很难发现污染问题，也很难避免或降低污染风险。DNA污染一旦发生就无法减少或消除。

因此，为了防止污染，在进行PCR实验时可以先用紫外线照射。DNA的紫外线照射会导致嘧啶二聚体的形成，从而阻止它们成为后续PCR中的有效模板。通过紫外线照射，可以将聚丙烯微量离心管中的HIV DNA模板减少1000倍以上。引物的灵敏度取决于序列和浓度。具有相邻胸腺嘧啶碱基的寡核苷酸比没有的寡核苷酸更容易受到紫外线的影响。Taq聚合酶对紫外线高度敏感，而脱氧核苷酸三磷酸相对抗紫外线。

紫外交联仪用于消除PCR污染

紫外交联仪是一个多用途的智能紫外照射系统，上海析浦科学仪器研发的紫外交联仪XEPU-1208系列和XEPU-1215系列都可以用于消除PCR污染。

XEPU-1208系列配备6根8瓦灯管，辐照室面积32 x 26 x 15cm。

XEPU-1208紫外交联仪产品介绍：析浦8瓦紫外交联仪XEPU-1208

XEPU-1215系列提供6根15瓦灯管，功率更大，且辐照室面积更大，44 x 34 x 15cm。可同时照射更多样品，实验效率更高。

XEPU-1215紫外交联仪产品介绍：析浦15瓦紫外交联仪XEPU-1215

下图：析浦8瓦紫外交联仪XEPU-1208，配有智能传感器、紫外防护板和大读数显示屏。

Reference:

Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N (December 1985). "Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia". Science. 230 (4732): 1350–54.

Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, et al. (January 1988). "Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase". Science. 239 (4839): 487–91.

Use of UV irradiation to reduce false positivity in polymerase chain reaction, C Y Ou, J L Moore, G Schochetman